La caratterizzazione delle alterazioni genetiche dei tumori rappresenta il fondamento su cui si basa la medicina personalizzata o medicina di precisione, che mira all’identificazione di quei biomarcatori che rappresentano il bersaglio contro il quale sarà rivolto il farmaco targeted (a bersaglio). I biomarcatori sono degli indicatori biologici che devono poter essere identificati, misurati e valutati oggettivamente.
La genomica è lo studio dell’intero genoma di un organismo, a differenza della genetica, che riguarda lo studio di un particolare gene. Con proteomica si definisce invece lo studio su larga scala dell’intero complesso proteico e delle sue alterazioni proteiche, prodotto da un organismo o da un sistema cellulare. Lo studio proteomico include informazioni quantitative sulla relativa abbondanza di una proteina, sulle sue variazioni e alterazioni strutturali, fino alla complessa interazione con le altre molecole facenti parte dello stesso network molecolare al fine di comprendere i processi cellulari nel loro insieme.
I farmaci a bersaglio molecolare e l’immunoterapia hanno rivoluzionato il trattamento del melanoma avanzato. Grazie all’utilizzo di questi farmaci è possibile ottenere risposte durature in un elevato numero di pazienti, migliorandone la sopravvivenza a lungo termine e la qualità di vita. Tuttavia, non tutti i pazienti ottengono lo stesso beneficio e non è ancora chiaro per quali pazienti sia più vantaggioso il trattamento in prima linea con la terapia “target” piuttosto che con l’immunoterapia.
La presenza della mutazione di BRAF è necessaria per l’utilizzo degli inibitori di BRAF in combinazione con inibitori di MEK, appartenenti alla categoria dei farmaci a bersaglio molecolare o “targeted therapy”. La mutazione di BRAF, riscontrata in circa la metà di tutti i melanomi non uveali, costituisce pertanto un fattore predittivo di risposta alla terapia con inibitori di BRAF+MEK: la maggior parte dei pazienti con la mutazione di BRAF (>80%) ottiene una regressione del tumore grazie al trattamento, mentre in assenza della mutazione non si può utilizzare questa terapia.
Il ruolo prognostico di BRAF, ossia la sua associazione con una migliore o peggiore sopravvivenza indipendentemente dal tipo di trattamento, è, invece, controverso: alcune casistiche hanno osservato un comportamento biologico più aggressivo in caso di presenza della mutazione di BRAF, mentre altri studi non hanno rilevato differenze significative con melanomi che non presentavano una mutazione di BRAF. Anche il ruolo prognostico della mutazione di NRAS, riscontrata in circa il 15-20% di tutti i melanomi non uveali e la seconda mutazione più frequente dopo BRAF, non è ancora definito, con i dati delle varie casistiche che puntano in direzioni diverse.
Alcuni importanti biomarcatori riguardano le caratteristiche immunologiche del tumore e del microambiente tumorale. In particolare, l’espressione di PD-L1 da parte delle cellule tumorali, ma anche delle cellule T CD8+ che infiltrano il tumore, sembra ricoprire un ruolo prognostico molto importante nei pazienti con melanoma metastatico, oltre che un potenziale effetto predittivo di risposta al trattamento con anticorpi anti-PD-1. Chiaro sembra essere il ruolo prognostico di PD-L1, associato infatti alla sopravvivenza globale dei pazienti con melanoma avanzato indipendentemente dal trattamento ricevuto. Altri tra i biomarcatori tissutali più studiati sono la densità e la qualità dell’infiltrato linfocitario tumorale, il carico mutazionale totale ed il relativo carico di neoantigeni e l’espressione delle molecole del complesso di istocompatibilità maggiore. I problemi generali associati allo studio e all’utilizzo dei biomarcatori tissutali sono dovuti alla ben documentata eterogeneità inter- e intra-tumorale ed ai cambiamenti dinamici di alcuni marcatori, in particolare dell’espressione di PD-L1, con risultati dipendenti dal sito e dal “timing” della biopsia.
SCOPO DEL PROGETTO
Lo studio in oggetto prevede l’analisi di una molteplicità di fattori prognostici, clinici, patologici e biomolecolari e la costruzione di un modello predittivo (nomogramma) da applicare ai pazienti con melanoma e linfonodo sentinella positivo per individuare il sottogruppo a maggior rischio che potrebbe beneficiare della disponibilità di nuove terapie e di nuove combinazioni di trattamenti adiuvanti, finalizzati cioè a ridurre le possibilità di una nuova ripresa della malattia. I nuovi orizzonti in ambito diagnostico-terapeutico, legati alla scoperta delle mutazioni delle cellule tumorali, richiedono un nuovo approccio multidisciplinare nella presa in carico del paziente con melanoma metastatico, per poter giungere alle decisioni terapeutiche più idonee ed efficaci.
Proponente: Prof. Daniela Massi
Coordinatore di Area Anatomia Patologica, IMI
Professore Associato, Università degli Studi di Firenze
Direttore, SOD Istologia Patologica e Diagnostica Molecolare, AOU Careggi, Firenze
Volume Editor, Classification of Skin Tumours WHO-IARC (4° Edizione, 2017)
Chair, EORTC Melanoma Pathology Group
Diagnosi istopatologica di melanoma e lesioni melanocitarie ambigue
La diagnosi istopatologica delle lesioni melanocitarie (melanoma e nevi melanocitici), attualmente basata su criteri cito-architetturali ed informazioni cliniche, è indicata nella letteratura internazionale come fonte di opinioni discordanti e scarsamente riproducibile. In particolare, esiste un subset di proliferazioni melanocitarie (lesioni spitzoidi) per le quali la refertazione è poco standardizzata e la diagnostica differenziale è estremamente complessa e pone il problema della identificazione del rischio del paziente, evitando la ‘sovradiagnosi’ (falso positivo), ma soprattutto la “sottodiagnosi” di lesione ad elevato rischio evolutivo (falso negativo). Pertanto, qualora il quadro morfologico ponga dei dubbi diagnostici è auspicabile la condivisione del caso e la richiesta di una consulenza esterna o cosiddetta “second opinion”. Consulenza esterna o cosiddetta “second opinion”
La consulenza esterna può essere richiesta dal patologo, dal clinico che ha in cura il paziente e/o dal paziente stesso. Essa comporta l’invio a distanza del/i vetrino/i ed in casi selezionati la ripetizione di indagini già effettuate e/o l’integrazione con metodiche genetico-molecolari ancillari (quali ibridazione in situ fluorescente, FISH). Il ricorso routinario (non selettivo) alla consulenza esterna per la patologia melanocitaria ha tuttavia costi non sostenibili.
Obiettivo del progetto
Il presente progetto è mirato alla creazione di una piattaforma IMI (Area Anatomia Patologica) attraverso la quale offrire ai pazienti con tumori melanocitari complessi second opinion diagnostiche e supporto con consulenze cliniche multidisciplinari al fine di minimizzare l’eterogeneità delle diagnosi e delle cure.
Inoltre, si propone la costituzione di un network di patologi IMI (con un coordinamento centrale) per la condivisione dei vetrini digitali (telepatologia). Il patologo del Centro Coordinatore manterrà la titolarità della refertazione e sarà l’interlocutore diretto dei clinici e dei pazienti. Tuttavia, la procedura intrinseca al network di telepatologia darà massima garanzia di condivisione e perciò della qualità ed accuratezza della diagnosi finale.
In ambito nazionale, la piattaforma IMI consentirà il rispetto del principio fondamentale di parità dei cittadini nella tutela della salute, offrendo ad essi condizioni diagnostiche equivalenti al livello più elevato di competenze professionali e specialistiche disponibile. Per le competenze che gli specialisti IMI rivestono nella diagnosi e nel trattamento del melanoma in Italia, la piattaforma costituirà un importante punto di riferimento e di analisi decisionale condivisa e personalizzata dei singoli casi.
Il proposto modello di gestione:
1. Utilizza qualificazioni professionali specifiche già esistenti in ambito IMI e risorse già in parte disponibili (il Centro Coordinatore dispone di un sistema di Telepatologia e di un portale web per la condivisione dei casi);
2. Offre un servizio coordinato unico in ambito nazionale;
3. Risponde alle necessità dell’utenza e sinergizza la qualificazione delle competenze che vi aderiscono;
4. Rappresenta la base operativa di un gruppo omogeneo, presupposto per una ricerca avanzata e traslazionale in collaborazione con specialisti IMI di altre Aree.
5. Consente la costituzione di un archivio con aggregazione di casi con potenziale interesse a fini didattici ed eventuale progettazione di percorsi formativi interdisciplinari ove le immagini di vetrini virtuali all’interno di Slide Seminars siano utilizzate per la discussione di casi clinici in ambito Master IMI.
Fasi realizzative del progetto
La realizzazione del progetto necessita della creazione di una infrastruttura tecnico-organizzativa dedicata ed in particolare:
1. Convenzione tra IMI e Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi (Centro Coordinatore)
Al fine di poter garantire la formalizzazione della consulenza (senza costi aggiuntivi per il paziente o per il clinico che ne fa richiesta) si prevede la stipula di una convenzione tra IMI e AOU Careggi (Centro Coordinatore) che preveda la revisione di 200-250 casi annui, ad un costo minimo istituzionale, da fatturare (fuori campo IVA, trattandosi di prestazioni in ambito sanitario) da AOU Careggi ad IMI, fino ad un impegno economico massimo per l’IMI di euro 20.000,00 (ventimila/00) annui, salvo acquisizione di risorse aggiuntive mirate da parte di IMI, e relativo ampliamento del numero di casi da poter sottoporre a second opinion.
2. Creazione interfaccia nella home page IMI
La richiesta di second opinion da parte del clinico o dello stesso paziente dovrà avvenire esclusivamente attraverso la home page IMI, al sito http://www.melanomaimi.it, dove sarà garantito l’accesso diretto alla modulistica necessaria per la registrazione dei dati minimi anagrafici, ai fini degli adempimenti amministrativi. In particolare, alla fine della procedura di registrazione sul sito IMI, si avrà la possibilità di stampa del modulo compilato riportante il codice progressivo IMI, che dovrà essere poi allegata alla spedizione dei preparati istopatologici da inviare al Centro Coordinatore (Resp. Prof. Daniela Massi).
Solo seguendo la suddetta procedura il caso sarà riconosciuto nell’ambito della piattaforma e quindi considerato gratuito per il richiedente e supportato dall’accordo IMI-AOU Careggi.
3. Creazione network patologi per la condivisione dei vetrini digitali
Sarà creato un network di 5 anatomo-patologi specialisti della disciplina, i quali potranno offrire la loro opinione sui preparati istopatologici digitalizzati (telepatologia), al fine di poter garantire ai pazienti – soprattutto nei casi di più difficile classificazione diagnostica – il più elevato livello di competenze professionali disponibile in Italia, attraverso la condivisione a distanza dei pareri sulla diagnosi.
4. Digitalizzazione dei preparati istopatologici ed utilizzo del portale di telepatologia
La digitalizzazione dei vetrini microscopici verrà effettuata avvalendosi del sistema D-Sight+ (Menarini Diagnostics, Firenze), ubicato presso il laboratorio di Anatomia Patologica, Dipartimento Chirurgia e Medicina Traslazionale, Università degli Studi di Firenze. Questo sistema, costituito dal microscopio digitale, dalla workstation di gestione e dall’infrastruttura di archiviazione e pubblicazione online sarà messa a disposizione dal Servizio Informatico dell’Ateneo Fiorentino (SIAF) e consentirà di scansionare l’intera superficie del preparato microscopico con elevati livelli di ingrandimento e risoluzione.
L’immagine digitale ottenuta sarà successivamente archiviata in maniera opportuna (codificata e nel rispetto delle condizioni di sicurezza e privacy), per poter poi essere reso accessibile dal network di anatomo-patologi della piattaforma a mezzo di sistemi di protezione di accesso. In particolare, l’accesso ai vetrini digitali avverrà attraverso il portale https://www.telepat.unifi.it/webdsightplus/main/index.xhtml
L’accesso ai casi sarà consentito ai patologi del network utilizzando username e password personalizzati e i vetrini virtuali potranno essere visualizzati senza la necessità di installazione di software dedicato. Sarà inoltre possibile arricchire i casi con descrizioni testuali oppure allegando file o immagini di formati diversi (.jpg; .pdf, .docx, .txt) che potranno essere scaricati e consultati durante la visualizzazione dei vetrini virtuali. In dettaglio, le descrizioni testuali specifiche di cui potranno essere corredati i vetrini virtuali potranno contenere informazioni sulle caratteristiche del tessuto incluso, sul tipo di colorazione impiegata, sui dettagli istopatologici da evidenziare, eccetera.
Nel caso emerga la necessità di condividere un singolo vetrino virtuale tra due o più patologi sarà per loro possibile utilizzare un link generato dal sistema (eventualmente condiviso via e-mail) che consentirà la visualizzazione immediata del preparato, senza la necessità di accedere con username e password al portale. Se ritenuto opportuno l’accesso diretto al vetrino virtuale potrà essere protetto da un PIN specifico.
L’equivalenza qualitativa fra le immagini del microscopio e le immagini scannerizzate è ampiamente dimostrata in letteratura. La telepatologia offre inoltre ulteriori vantaggi:
i. visualizzazione e confronto in parallelo di più vetrini sullo stesso monitor;
ii. reperimento in tempi rapidi di immagini precedenti associate allo stesso paziente o immagini comparabili da altri pazienti;
iii. teleconsulto e discussione interattiva tra più patologi anche localizzati in sedi diverse;
iv. mantenimento della qualità dell’immagine nell’arco del tempo, con migliore garanzia di durata e stabilità nel tempo delle informazioni senza il rischio di perdita o danneggiamento di materiale ‘unico’.
5. Consulenza clinica
Qualora vi sia una specifica richiesta e per casi particolarmente complessi (comprese le lesioni in età pediatrica), si prevede la possibilità di condividere il referto formulato in second opinion con consulenti clinici dell’IMI, i quali possano fornire un parere sulla gestione clinica (trattamenti chirurgici o medici, consulenza genetica, follow-up).
6. Creazione database con finalità didattiche e di ricerca
Il progetto prevede la creazione di un database centralizzato finalizzato ad attività di ricerca traslazionale e formazione in ambito di iniziative IMI.
Risorse da acquisire
In aggiunta alle risorse finanziarie che l’IMI dovrà impegnare per l’attivazione presso l’AOU Careggi del servizio di second opinion (secondo le indicazioni riportate al punto 1 del precedente capitolo), si dovrà prevedere la stipula di un contratto o borsa di studio per la gestione del sistema D-Sight+ e del database: i) digitalizzazione dei preparati microscopici, ii) pubblicazione dei vetrini digitalizzati sul portale di telepatologia dell’Università degli Studi di Firenze, iii) classificazione all’interno di un contesto specifico (progetto), iv) aggiunta delle informazioni che saranno disponibili durante la loro visualizzazione, v) creazione del database.
In fase di implementazione del progetto, potranno essere previste fondi aggiuntivi per l’acquisto di risorse hardware che possano essere utilizzate per incrementare sia lo spazio di archiviazione disponibile, vista la considerevole dimensione di ciascun vetrino virtuale, sia la capacità del sistema di sostenere la consultazione simultanea dei vetrini virtuali stessi da parte di un numero crescente di osservatori nel caso di sviluppi su attività didattico-formative.
Progetto di ricerca finanziato con i contributi 5x1000 dell’anno 2014 (dichiarazione 2015).
MARKERS IMMUNOLOGICI DI PROGRESSIONE E RESISTENZA ALLE TERAPIE NEI PAZIENTI CON DIAGNOSI DI MELANOMA
Fino a poco tempo fa lo scopo del trattamento della malattia metastatica non operabile poteva considerarsi quasi esclusivamente palliativo, dal momento che i chemioterapici a disposizione dimostravano un effetto limitato e non curativo nella maggior parte dei casi. Negli ultimi anni il progressivo affermarsi di nuovi farmaci immunomodulanti o sensibili a determinati profili genetici del tumore ha permesso di osservare dei vantaggi in termini di sopravvivenza.
Immunoterapia. E’ basata su anticorpi monoclonali diretto verso recettori presente sui linfociti e che regolano normalmente la risposta immunitaria. Il legame del l’anticorpo con il suo ligando genera un segnale negativo che viene utilizzato dalle cellule tumorali per disattivare l’attivazione immunitaria. Il legame dell’anticorpo ad una molecola specifica impedisce l’innesco del segnale negativo che si traduce in un potenziamento delle difese immunitarie. Tale immunoterapia ha ricevuto l’approvazione nel trattamento del melanoma metastatico.
Terapie a bersaglio molecolare. Nel melanoma l’attivazione costitutiva di segnali geneticamente regolati è implicata nella proliferazione, invasione e resistenza alle terapie. Nel 50% dei melanomi la mutazione attivante è a carico del gene BRAF, nel 20 % sono presenti mutazioni del gene NRAS mutualmente esclusive rispetto a quelle di BRAF.
Le mutazioni dei geni NRAS e BRAF sono state identificate con alta frequenza sia in nevi che in melanomi cutanei. Pertanto esse rappresentano eventi precoci nello sviluppo dei tumori melanocitari. L’inibizione di BRAF mutato mediante inibitori specifici ha marcati effetti antitumorali nelle linee di melanoma che presentano la mutazione BRAF.
Anche se questi nuovi agenti hanno significativamente modificato lo scenario terapeutico del melanoma metastatico, questi hanno delle limitazioni nell’efficacioa della propria azione nel tempo e ciò evidenzia la necessità di ulteriori studi. I futuri studi clinici dovranno essere tesi a migliorare l’efficacia di tali farmaci attraverso il disegno di regimi di combinazione o sequenziali sia con entrambi i farmaci sia con altri principi attivi di tipo, immunoterapico o a bersaglio molecolare.
Il trattamento del melanoma cutaneo si trova quindi a dover affrontare due urgenti necessità:
– Definire, quando questa malattia è ancora in una fase iniziale, nuovi fattori prognostici che possano predire più efficacemente il rischio di progressione clinica, rispetto ai fattori isto-patologici convenzionali che a tutt’oggi si conoscono e che non appaiono sufficienti e adeguati a questa finalità.
-Comprendere quali sono I geni più importanti che regolano il controllo rispetto alla resistenza che il tumore oppone ai più avanzati trattamenti terapeutici disponibili come l’immunoterapia e le terapia correlata al profilo genetico del melanoma.
Questi due rilevanti obiettivi sono strettamente correlati, poiché comuni processi biologici, sotto controllo degli stessi geni regolatori, contribuiscono a promuovere la formazione di metastasi del melanoma e a determinare una resistenza alle terapie.
Lo studio si propone di sviluppare algoritmi prognostici nel melanoma primitivo (quindi ancora in assenza di metastasi) basati su un’ analisi integrata della morfologia delle cellule tumorali da parte degli anatomo-patologi in modo da evidenziare quali marcatori regolano lo sviluppo e i processi di biologici delle cellule tumorali che portano verso comportamenti di maggiore aggressività.
L’altro obiettivo dello studio è quello individuare i geni immunoregolatori nel tumore primitivo e nelle metastasi e di correlare l’analisi immunologica con i meccanismi di trascrizione genetica, per poter comprendere le modalità con cui viene regolata l’azione prognostica della malattia.
Queste nuovi filoni di ricerca di anatomia patologica integrata alle analisi di biologia molecolare e genetica si propongono di proseguire l’approccio nel trattamento del melanoma, che si affianca a quelli tradizionali rappresentati dalla chirurgia, dalla radioterapia e dalla chemioterapia. L’immuno-oncologia rappresenta una forma di bioterapia: quest’ultima comprende tutti quei trattamenti che inducono modificazioni nel nostro organismo per favorire una forte reazione contro il tumore, senza distruggere direttamente le cellule malate. Le risposte cliniche possono manifestarsi anche alcuni mesi dopo l’inizio della somministrazione del farmaco immuno-oncologico, ma in genere durano più a lungo. Una progressione della malattia non implica in questi casi la necessaria rinuncia al trattamento come accade invece per i farmaci chemioterapici. Siamo quindi di fronte a un nuovo modo di valutare la terapia nei pazienti trattati.
In questa prospettiva, il nostro studio rappresenta un contributo per colmare significativi bisogni clinici insoddisfatti di salute nei pazienti con melanoma. Per questo abbiamo intrapreso un programma di sviluppo clinico-sperimentale per offrire alle terapie immuno-oncologiche le migliori condizioni per poter espletare la loro azione con l’obiettivo di modificare le aspettative di sopravvivenza e il modo in cui i pazienti affrontano e convivono con il melanoma.
Progetto di ricerca finanziato con il contributo di Aon Benfield e metà con Aon RE Trust (www.aon.com)
INTRODUZIONE
(a) Il fenomeno CX.Alcuni anni fa il nostro gruppo, operante presso il National Cancer Institute (NIH; Bethesda, Md, USA), dimostrò per la prima volta che il trattamento con composti triazenici di topi portatori di leucemia sperimentale determinava la comparsa di nuovi antigeni a livello della cellula neoplastica. Questo fenomeno venne denominato “xenogenizzazione chimica” (Chemical Xenogenization, CX, Bonmassar L et al, Curr Med Chem 2013, 20: 2389-2401) in quanto il farmaco rende le cellule maligne totalmente incompatibili con l’ospite, con conseguente risposta immunitaria che elimina il tumore in modo estremamente efficace e duraturo. In seguito, si ottennero prove dirette che CX è dovuto ad induzione di mutazioni a livello della cellula neoplastica. Tuttavia, la mancanza di metodi adeguati a incrementare in clinica le risposte immunitarie del paziente verso antigeni tumorali CX- indotti, impedì per molti anni che questa importante osservazione superasse il livello puramente sperimentale preclinico.
Il melanoma cutaneo è un tumore che ha origine nei melanociti della pelle e la cui incidenza è in continuo aumento. Se viene riconosciuto nelle fasi iniziali, l’asportazione chirurgica ne rappresenta il trattamento d’elezione; in fasi più avanzate, invece, il melanoma si presenta come un tumore molto aggressivo che può dare origine a metastasi invadendo altri organi. Le opzioni terapeutiche per i pazienti con melanoma metastatico sono tuttora limitate. I trattamenti a base di composti chemioterapici o di farmaci immunoterapici sono spesso associati a risposte limitate, effetti collaterali gravi e sviluppo di resistenza.
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